Биохакеры: молекулярная биология в стиле «сделай сам»

Upsidesium · **Posted:** 27 Feb 2014 21:49

По идее особых изменений не должно быть ПЭГ-1500, ПЭГ-4000 и ПЭГ-6000 это все высокомолекулярные этиленгликоли.

Tigtinc · **Joined:** 10 Mar 2013 19:12 **Posts:** 205

Dorif wrote:

Вопрос: если в методиках, по которым нужен ПЭГ 6000 использовать ПЭГ 1500(есть только он у меня) - что изменится от этого? Спасибо!

А что за протокол?
Возможно придется немного увеличить концентрацию.

Dorif · **Posted:** 27 Feb 2014 22:46

Вот протоколы с ПЭГ: http://molbiol.ru/protocol/09_02.html (не указана мол масса)
http://molbiol.ru/protocol/08_01.html (ПЭГ 6000 или 8000)
http://molbiol.ru/protocol/04_06.html (ПЭГ 6000)
http://molbiol.ru/protocol/03_07.html (ПЭГ 3000)
Заменить можно как-то?

Tigtinc · **Joined:** 10 Mar 2013 19:12 **Posts:** 205

Ну, в какой-то книге читал что для трансфекции можно использовать ПЭГ 1000-8000.
Очевидно можно попробовать просто поиграть с концентрацией.

Code:

Трансфекция протопластов с помощью полиэтиленгликоля

Полиэтиленгликоль представляет собой сильно гидрофиль­ное вещество и способен связывать много «свободной воды» в растворе; «свободная вода» — это молекулы, доступные для взаимодействия с заряженными молекулами (обычно ионами), растворенными в воде. Таким образом, при высоких концентра­циях ПЭГ такие макромолекулы, как ДНК, больше не могут оставаться в растворе и осаждаются. Мембрана протопласта в норме отрицательно заряжена. Благодаря фосфатным группам ДНК тоже имеет отрицательный заряд, и, следовательно, взаимное отталкивание зарядов препятствует взаимодействию между ДНК и протопластами. При очень высоких концентраци­ях (30—40% вес на объем) ПЭГ также, по-видимому, мини­мизирует взаимное отталкивание зарядов; таким образом, клеточные мембраны могут прийти в тесный контакт с возмож­ным слиянием липидных бислоев и впоследствии после разведе­ния со слиянием клеток. Было показано, что полиэтиленгликоль представляет собой и сильный стимулятор эндоцитоза у прото­пластов растений; при добавлении ПЭГ они способны поглощать большие частицы, например целые хлоропласты, липосомы или бактерии. Таким образом, общий механизм воздействия ПЭГ не совсем ясен, однако, вероятно, подразумевает преципитацию плазмидной ДНК на плазматической мембране и затем стиму­ляцию ее поглощения путем эндоцитоза. 
(с) Интернет

Dorif · **Posted:** 19 Aug 2014 16:06

Вопрос: сейчас для ПЦР используют нуклеозидтрифосфаты, а что изменится в протоколе осуществления ПЦР, если использовать натриевые соли нуклеозиддифосфатов?

Вообще: НДФ можно в ПЦР юзать?

Спасибо!

Dorif · **Posted:** 24 Aug 2014 20:23

И можно ли использовать альбумин вместо сыворотки крови при культивации животных клеток?

И да в современных средах я вот не вижу антибиотиков. А в советской литературе подробно расписано, как и в каком количестве их в среды добавлять и рецепты сред приводятся сразу с антибиотиками. Почему так?

Спасибо!

Upsidesium · **Posted:** 24 Aug 2014 23:12

Dorif wrote:

Вопрос: сейчас для ПЦР используют нуклеозидтрифосфаты, а что изменится в протоколе осуществления ПЦР, если использовать натриевые соли нуклеозиддифосфатов?

Вообще: НДФ можно в ПЦР юзать?

Спасибо!

Это нужно на молбиоле протоколы смотреть.

Dorif wrote:

И можно ли использовать альбумин вместо сыворотки крови при культивации животных клеток?
И да в современных средах я вот не вижу антибиотиков. А в советской литературе подробно расписано, как и в каком количестве их в среды добавлять и рецепты сред приводятся сразу с антибиотиками. Почему так?
Спасибо!

Можно использовать гидролизат лакт-альбумина.

Dorif · **Posted:** 25 Aug 2014 11:42

Гидролизата нет. Только негидролизованный. И вроде смотрю, в некоторых средах используется. Например, Ham F-12 среда с человеческим альбумином используется для культивации перевиваемых культур клеток хомячков. Интересно, насколько полноценной эта замена будет для человеческих клеток и для первичных культур.

Upsidesium · **Posted:** 25 Aug 2014 20:59

Dorif wrote:

Гидролизата нет. Только негидролизованный. И вроде смотрю, в некоторых средах используется. Например, Ham F-12 среда с человеческим альбумином используется для культивации перевиваемых культур клеток хомячков. Интересно, насколько полноценной эта замена будет для человеческих клеток и для первичных культур.

А какова цель эксперимента?

Dorif · **Posted:** 25 Aug 2014 23:11

а) научиться выращивать культуры клеток животных.
б) научиться выращивать вирусы на культурах клеток. Вирусами будут герпесвирусы, как доступные и относительно безопасные в обращении.

Добыл лиофилизат бычьего альбумина.

Tigtinc · **Joined:** 10 Mar 2013 19:12 **Posts:** 205

Dorif wrote:

И да в современных средах я вот не вижу антибиотиков. А в советской литературе подробно расписано, как и в каком количестве их в среды добавлять и рецепты сред приводятся сразу с антибиотиками. Почему так?
Спасибо!

Добавляют но отдельно.
Сейчас клетки часто генетически модифицируют и вводят маркеры устойчивости к антибиотикам + для биохимии важно чтоб среда была чистой, итд.
Потому выпускают "голую" среду в которую уже добавляют то что нужно по протоколу.
Да и асептика была другая. Сейчас ламинар, а раньше спиртовка)

Quote:

И можно ли использовать альбумин вместо сыворотки крови при культивации животных клеток?

А что, кровь достать проблема?)

Quote:

а) научиться выращивать культуры клеток животных.
б) научиться выращивать вирусы на культурах клеток. Вирусами будут герпесвирусы, как доступные и относительно безопасные в обращении.

А бактериофаги и клеточные культуры растений не интересны?
С ними гораздо удобнее и проще руку набить..

Dorif · **Posted:** 26 Aug 2014 13:58

Растения пробовал. Каллусы хорошо растут. получал из овощей. Потом закончились фитогормоны, найденные в НИИ... Всего пара фанфуриков было.(

Гетероауксин у нас нынче как, не шибко дорог должен быть?

А бактериофаги, честно говоря, до сих пор достать не могу.(

А кровь к нужных для культур количествах достать реально проблема. Я ж внутривенные инъекции не умею делать, так что сам взять кровь не могу. А на станцию переливания за просрочкой хз как подойти просто, что сказать и т.п.

Tigtinc · **Joined:** 10 Mar 2013 19:12 **Posts:** 205

Dorif wrote:

Растения пробовал. Каллусы хорошо растут. получал из овощей. Потом закончились фитогормоны, найденные в НИИ... Всего пара фанфуриков было.(

Гетероауксин у нас нынче как, не шибко дорог должен быть?

А бактериофаги, честно говоря, до сих пор достать не могу.(

А кровь к нужных для культур количествах достать реально проблема. Я ж внутривенные инъекции не умею делать, так что сам взять кровь не могу. А на станцию переливания за просрочкой хз как подойти просто, что сказать и т.п.

А что такое фанфурик?
Можно заказать на фирме или просто на ебей. Да и нужно их в среды 0.1-2 мг на литр...
http://www.ebay.com/itm/Spectrum-Indole ... 2c7a522ddc
http://www.ebay.com/itm/6-Benzylaminopu ... 1c4474ab29
итд

Кровь на скотобойне, в селе, с мышей, в интернете итд. Только гепарина захватить не забудь.

Бактериофаги можно попробовать и самому выделить. Попадалась когда-то методичка в которой их для сапрофитов выделяли из грунта.

Upsidesium · **Posted:** 26 Aug 2014 15:31

Dorif wrote:

Растения пробовал. Каллусы хорошо растут. получал из овощей.

А скрестить путем слияния каллюсов растения не пробовали?

Dorif wrote:

Гетероауксин у нас нынче как, не шибко дорог должен быть?

Да его и синтезировать не сложно. Вместо фитогормонов микродозы солей марганца можно использовать.

Trel · **Joined:** 15 Mar 2011 16:29 **Posts:** 4837

Препарат под названием "Гетероауксин" продают в садоводческих магазинах, сколько его там на самом деле - Ктулху знает.

Dorif · **Posted:** 26 Aug 2014 15:47

Tigtinc wrote:

Dorif wrote:

Растения пробовал. Каллусы хорошо растут. получал из овощей. Потом закончились фитогормоны, найденные в НИИ... Всего пара фанфуриков было.(

Гетероауксин у нас нынче как, не шибко дорог должен быть?

А бактериофаги, честно говоря, до сих пор достать не могу.(

А кровь к нужных для культур количествах достать реально проблема. Я ж внутривенные инъекции не умею делать, так что сам взять кровь не могу. А на станцию переливания за просрочкой хз как подойти просто, что сказать и т.п.

А что такое фанфурик?
Можно заказать на фирме или просто на ебей. Да и нужно их в среды 0.1-2 мг на литр...
http://www.ebay.com/itm/Spectrum-Indole ... 2c7a522ddc
http://www.ebay.com/itm/6-Benzylaminopu ... 1c4474ab29
итд

Кровь на скотобойне, в селе, с мышей, в интернете итд. Только гепарина захватить не забудь.

Бактериофаги можно попробовать и самому выделить. Попадалась когда-то методичка в которой их для сапрофитов выделяли из грунта.

Фанфурик - маленький флакончик.

6-БАП сам осилю сделать, только в универ вернусь - аденина у меня много. Грамм 20.

А гепарин не нужен. Суть как раз в отделении форменных элементов крови. Один из методов - просто дать коагулировать. Остаётся сыворотка, то бишь - дефибринированная плазма.

А можно методику выделения фагов, плиз?)

Dorif · **Posted:** 26 Aug 2014 15:49

Upsidesium wrote:

[А скрестить путем слияния каллюсов растения не пробовали?
Да его и синтезировать не сложно. Вместо фитогормонов микродозы солей марганца можно использовать.

А какова методика слияния каллюсов?

А соли марганца в среды и так же входят. Как микроэлемент.

Tigtinc · **Joined:** 10 Mar 2013 19:12 **Posts:** 205

Гибриды получают слиянием протопластов.
Каллюсом сложновато будет, хотя можно попробовать это с клеточной суспензией. Тот же каллюс выращивать в жидкой среде на шейкере.
Заменить марганцем фитогормоны не получится. Хотя бы потому что соотношением гормонов в среде мы корректируем рост растения, каллюс, корни, меристемы, итд.

Про приготовление сред это вообще отдельная история. Термолабильные гормоны я разводил в спирте и добавлял в среду после стерелизации, это вместо фильтрации.
Также ее легко перегреть при стерелизации и сахароза карамелизируетя, среда-то ксислая. И рН легко уплывает.
В качестве селективного фактора, вместо антибиотиков, лучше добавлять сорбат и бензоат, где-то даже патент был. Амерекосы производят сабж под этой маркой http://www.plantcelltechnology.com/about-ppm/
Еще можно добавлять фенбендазол от контаминации клещами.

Методичку про фаги видел в какой-то библиотеке, причем мельком. Но думаю сначала фильтрация через фильтр 0.22, смешать с суспензией клеток и засеять газоном. Фаги будут пустыми пятнами.

Про кровь, так с гепарином можно убить двух зайцев, и на агар и на клетки. Кста, погуглил, продают свиную замороженную кровь.

Dorif · **Posted:** 26 Aug 2014 17:22

Тогда можно не гепарином, а ЭДТА или цитратом и на центрифугу. Только центрифуги нет.( Даже ручной.( Хотя м.б. у аналитиков добуду какую-нить старенькую.

Ну и осаждать из плазмы фибриноген избытком солей кальция.

А про бензоаты - у меня бензоат аммония в большой банке еззь. Так что вполне себе реально. Но это вроде только для культур клеток растений годится? Я их вообще без антибиотиков готовил.

Upsidesium · **Posted:** 26 Aug 2014 17:46

Tigtinc wrote:

Гибриды получают слиянием протопластов.
Каллюсом сложновато будет, хотя можно попробовать это с клеточной суспензией. Тот же каллюс выращивать в жидкой среде на шейкере.

Эм. А как протопласты растительных клеток получить?

Биохакеры: молекулярная биология в стиле «сделай сам»

Who is online